Académie royale de Médecine de Belgique

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Texte Paul Lechat

(Séance du samedi 28 mai 1983)  

INVESTIGATIONS PHARMACOLOGIQUES SUR LES CELLULES MYOCARDIQUES EN CULTURE  

par Paul LECHAT (Institut de Pharmacologie de l’Université Pierre et Marie Curie – Paris), invité.

Le maintien d’un organe en survie artificielle in vitro est un vieux rêve des biologistes, mais la première réussite de ce genre de tentative ne date que du début du XXème siècle.  Le cœur a passionné spécialement les expérimentateurs, ce qui est facile à comprendre en raison de son importance vitale et de l’impact psychologique de toute expérience faite sur cet organe, comme l’atteste l’intérêt soulevé par les transplantations cardiaques tentées chez l’Homme depuis quelques années.

C’est en 1910 que le physiologiste américain Burrows, seul d’abord, puis avec le français Alexis Carrel, montra qu’un fragment de cœur d’embryon de poulet, mis en culture dans une goutte de plasma, pouvait continuer à y battre durant plusieurs jours.  Pendant les quarante années suivantes, on s’intéressa exclusivement aux cultures d’organes, et il fallut attendre la mise au point de la technique de trypsination, faite en 1952 par Moscona, pour que les cultures de cellules prennent leur essor.

Les possibilités offertes aux pharmacologistes par les cellules cardiaques en culture diffèrent de celles des préparations classiques.  En effet :

L’effet cellulaire direct des médicaments peut y être mis en évidence,

Cet effet est spécifique du myocyte, puisque les autres cellules présentes dans le cœur entier (cellules endothéliales, cellules des fibres lisses vasculaires) peuvent être éliminées,

Il n’y a plus de problème de diffusion dans le liquide interstitiel et la concentration des substances actives au contact des cellules est connue avec précision,    

Enfin, des quantités minimes de produit suffisent pour réaliser les essais.

Les caractéristiques mesurables sont : la fréquence des battements, la force contractile, l’activité électrique (potentiel de membrane et potentiel d’action recueillis à l’aide de micro-électrodes), les activités enzymatiques.  Des techniques appropriées ont été mises au point pour y parvenir et leurs possibilités ont été passées en revue récemment (Auclair et Freyss, 1980 ; Schanne et Bkaily, 1981).

Il ne faut toutefois pas se dissimuler les difficultés de ce type d’expérimentation, et la nécessité de suivre une méthodologie rigoureuse.

Enfin, la transposition des résultats ainsi obtenus aux effets in vivo doit être extrêmement prudente, compte tenu des régulations nerveuses et circulatoires présentes dans l’organisme entier, sur lesquelles les médicaments administrés à l’homme ou à l’animal exercent leur influence, et qui sont absentes des cultures cellulaires.

Les recherches pharmacologiques effectuées sur un tel matériel sont relativement récentes ?  Sur des cultures de cellules de cœur embryonnaire de poulet, M. et D. Cavanaugh ont été les premiers à montrer (1957) l’influence de la quinidine, qui diminue la fréquence et l’amplitude des contractions à une concentration non toxique.  Sur ces mêmes cellules, Mercer et Dower (1966) ont comparé les effets de la digoxine, de la quinidine et du procaïnamide. Quant aux cultures cardiaques de mammifères, le mérite revient à Harary et Farley (1963) de les avoir mises au point les premiers chez le rat ; d’autres animaux ont été utilisés par la suite : souris, chat, cobaye, hamster, mais le rat demeure le plus courant pour des raisons pratiques.  Le premier travail pharmacologique effectué grâce à elles paraît être celui de Wollenberger (1964) qui mit en évidence l’effet chronotrope positif des catécholamines.  A partir de 1971, nous avons commencé dans notre laboratoire des recherches sur les cultures de cellules cardiaques de rat, et nous exposons ici quelques-uns des résultats obtenus.     

Protocole expérimental adopté  

Des cœurs de rats âgés de deux à trois jours sont prélevés aseptiquement dans une solution saline, de Hanks, coupés en petits fragments et soumis à une trypsinisation fractionnée. Après centrifugation à +4°C, le culot cellulaire obtenu est dispersé dans le milieu de culture (milieu essentiel minimal de Eagle additionné de sels d’Earle et de sérum de veau à raison de 10 ml pour 100 ml de milieu), puis filtré sur papier Japon pour éliminer les agglomérats de cellules.  Le nombre des cellules présentes par ml est déterminé à l’hématimètre, puis la suspension est diluée avec du milieu de culture, afin d’obtenir une concentration de 250.000 cellules par ml.  Cette suspension cellulaire est répartie dans les tubes de Leighton, à raison de 2 ml par tube, la phase gazeuse étant constituée d’air contenant 5 % de CO2-.  Six jours après la mise en culture sans changement de milieu (ce qui ralentit la prolifération des fibrocytes, ainsi que nous l’avons observé), on obtient une population cellulaire constituée de myocytes disposés en étoile sur un tapis de fibrocytes.  Les myocytes battent spontanément, de façon syncrhome : dans nos conditions expérimentales (p02 du milieu 120 à 140 mm de mercure, température de 35°), la fréquence mesurée par observation microscopique directe, est de 100 par minute, en moyenne.  Les traitements sont effectués en remplaçant le milieu de culture par du milieu neuf contenant différentes concentrations du produit à essayer.

Effet des antidépresseurs imipraminiques

Ce sont des cliniciens français de Nancy (Michon, Larcan et al, 1959) qui ont attiré les premiers l’attention sur les altérations graves de l’électrocardiogramme provoquées par l’imipramine, à propos du premier cas d’intoxication volontaire mortelle chez une jeune fille de 19 ans.  Depuis lors, de nombreux cas de suicides par les antidépresseurs tricycliques ont été enregistrés.

Le mécanisme de cette action toxique est donc très important à connaitre, d’autant plus qu’il n’existe pas à l’heure actuelle d’antidotes en cas d’intoxication aiguë, et que les seuls traitements connus sont des traitements symptomatiques. Les recherches expérimentales dans ce domaine n’ont commencé qu’après les constatations cliniques, puisque le premier travail pharmacologique sur les complications cardiovasculaires de l’imipramine est celui de Cairncross et Gershon en 1962.

Alors que chez l’homme ou l’animal entier, l’imipramine accélère le cœur, en raison de ses propriétés anticholinergiques, sur des cellules cardiaques cultivées de rat, elle est bradycardisante.  Ajoutée à des concentrations croissantes au milieu de culture : à 1 µg/ml, aucune modification de la fréquence, même au bout de deux heures de contact ; avec 5 et 10 µ/ml, arrêt complet de battements en moins de cinq minutes.  Cette inhibition est difficilement réversible : il faut effectuer au moins deux lavages et attendre 24 heures pour que les battements reprennent.

Dans un milieu sans potassium, la fréquence des battements est très augmentée, mais ceux-ci deviennent très faibles.  L’imipramine à 5 µg/ml reste alors sans effet et, même à 10 µg/ml, elle arrive seulement à ralentir la fréquence.  Ce résultat est en accord avec nos observations antérieures faites in vitro et in vivo, selon lesquelles la toxicité de l’imipramine augmente en présence d’un excès d’ions K +.  D’autres données nous ont conduits à avancer l’hypothèse selon laquelle l’imipramine ne modifie pas les mécanismes de la contractilité cardiaque, mais altère les processus d’automaticité en modifiant la perméabilité membranaire de la cellule myocardique à l’ion Na+.

Cette action de l’imipramine se retrouve chez d’autres antidépresseurs tricycliques (amitriptyline, mélitracène), tandis qu’un dérivé tricyclique non-antidépresseur, l’azatadine, augmente la fréquence cardiaque, même aux fortes doses.

Dans une série d’essais ultérieurs, nous avons recherché dans quelle mesure deux substances plus récemment proposées comme antidépresseurs, mais de structure tétracyclique, la miansérine et la maprotiline possèdent ou non elles aussi un effet bradycardisant direct.  Or, si la miansérine agit sensiblement comme l’amitriptyline, la maprotiline se montre beaucoup moins toxique, puisqu’il faut atteindre une concentration de cinq à dix fois plus grande pour arrêter tout battement.

Chez les intoxiqués à l’imipramine, Gauthier et al. ont montré dès 1968 que la perfusion veineuse de bicarbonate ou de lactate de sodium corrige les troubles cardiaques.  Expérimentalement, nous avons retrouvé cet effet protecteur sur le lambeau myocardique isolé de rat et sur les cellules cardiaques de rat en culture, vis-à-vis des antidépresseurs tricycliques.  Nous avons recherché si le bicarbonate de sodium corrige également des troubles provoqués par le miansérine et la maprotiline.  A notre surprise, tandis que le bicarbonate de sodium rétablit en partie les battements des cellules arrêtées par l’imipramine, il est inefficace vis-à-vis des deux tétracycliques, dont il aggrave au contraire l’effet toxique.  Ces données (Daoud El-Assaf, 1982) montrent que le mécanisme de l’effet cardiaque est différent pour les antidépresseurs tri et tétracycliques, et que l’apport de bicarbonate de sodium est a priori contre-indiquée en cas d’intoxication aiguë par ces derniers.

Effet de l’histamine sur les cellules cardiaques en culture

Alors que les imipraminiques nous ont fourni l’illustration d’un effet chronotrope négatif, nous allons voir à présent avec l’histamine le cas d’une substance exerçant un effet chronotrope positif sur les cellules cardiaques en culture.  Il est connu depuis longtemps que l’histamine accélère le cœur des mammifères adultes, mais le mécanisme de cette action reste discuté. La participation des récepteurs H1 et H2 a été avancée, mais des résultats divergents ont été publiés. L’influence de l’histamine sur le cœur de l’animal nouveau-né n’ayant pas été recherchée, nous avons utilisé des cultures de cellules cardiaques de rats âgés de deux jours pour l’étudier.  Nos résultats ont été les suivants :

Alors que les imipraminiques nous ont fourni l’illustration d’un effet chronotrope négatif, nous allons voir à présent avec l’histamine le cas d’une substance exerçant un effet chronotrope positif sur les cellules cardiaques en culture.  Il est connu depuis longtemps que l’histamine accélère le cœur des mammifères adultes, mais le mécanisme de cette action reste discuté. La participation des récepteurs H1 et H2 a été avancée, mais des résultats divergents ont été publiés.  L’influence e l’histamine sur le cœur de l’animal nouveau-né n’ayant pas été recherchée, nous avons utilisé des cultures de cellules cardiaques de rats âgés de deux jours pour l’étudier.  Nos résultats ont été les suivants (Csete et al., 1978) :

L’histamine exerce un effet chronotrope positif, proportionnel à la dose, dans un intervalle de concentration 1.10-6 M à 1.10-5 M. L’action devient maximale après quinze minutes de contact, se maintient jusqu’à 45 minutes, puis disparaît.  En outre, l’histamine exerce un effet inotrope positif.

Effet des bloquants des récepteurs H. La prométhazine et la mépyramine suppriment presque complètement l’effet chronotrope positif de l’histamine, à des concentrations où elles ne modifient pas elles-mêmes la fréquence cardiaque.

Effet des bloquants des récepteurs H2. Le métiamide et la cimétidine dépourvus également d’effet propre sur la fréquence cardiaque, diminuent l’effet chronotrope positif de l’histamine, mais moins puissamment que ne le font les bloquants des récepteurs H1.

Effet des bloquants des récepteurs H1 et H2. Ajoutés ensemble au milieu de culture, le métiamide et la prométhazine n’inhibent pas l’effet chronotrope positif de l’histamine plus fortement que ne le fait la prométhazine seule.

Les cellules cardiaques du rat nouveau-né semblent donc posséder des récepteurs histamiques.  Il est possible que les deux types connus H1  et H2  y soient présents, avec sans doute une prédominance es H, compte tenu de l’effet antagoniste plus puissant exercé par la mépyramine et la prométhazine.

Effet des inhibiteurs du courant calcique lent

Comme celle d’autres préparations cardiaques, l’activité contractile des cellules cardiaques cultivées est liée principalement au fonctionnement du canal calcique lent.  Cependant, ces cellules ont une faible perméabilité sodique rapide et une faible perméabilité potassique comme en témoigne leur faible sensibilité à la tétrodotoxine et aux variations du potassium extracellulaire.  Elles doivent donc, en revanche, permettre la mise en évidence d’actions sur le canal lent avec des interactions faibles sur les perméabilités sodique rapide et potassique.

L’influence de trois inhibiteurs : diltiazem, nifédipine et vérapamil a été étudiée sur la contractilité (enregistrée par méthode électro-optique) et les potentiels d’action (enregistrés par micro-électrodes) de celles cardiaques cultivées de rat nouveau-né stimulées à fréquence 2 Hz.  La concentration nécessaire pour diminuer la contractilité de 30 % a été déterminée : dilitazem 3 x 10-9 M, niféfipinr 1 x 10-9 M et vérapamil 2 x 10-8 M exercent le même effet qu’une diminution de 0,54 mM du calcium extracellulaire.  En milieu hyperpotassique (20 mM) ces substances, aux mêmes concentrations, diminuent l’amplitude de la contraction et du potentiel d’action.

L’ensemble de ces résultats montre que les cellules cardiaques cultivées de rat nouveau-né sont très sensibles aux modificateurs de l’activité calcique lente, mais qu’elles présentent une sensibilité particulière aux inhibiteurs calciques puisqu’elles permettent de détecter des concentrations très faibles de diltiazem ou de nifédipine 10-9 M et de vérapamil 10-7 M, inférieures donc aux concentrations minimales actives sur d’autres préparations cardiaques.

Effet de sérums venant de patients en état de choc septique

La dépression cardiaque au cours du choc septique est bien établie.  Le rôle de facteurs circulants a été plusieurs fois envisagé pour expliquer la cardiodépression de la phase terminale du choc.  Cependant, ce n’est qu’à l’aide de cellules cardiaques cultivées sur nous avons pu mettre en évidence la présence d’un facteur circulant cardiodépresseur au cours des phases précoces du choc septique.  En effet, ces cellules supportent bien la présence d’un facteur circulant cardiodépresseur au cours des phases précoces du choc septique.  En effet, ces cellules supportent bien la présence de sérum humain.  Celui-ci n’est pas dénaturé par la présence du bullage d’oxygène nécessaire aux autres préparations cardiaques puisque les cellules en culture ont, par seul contact avec l’air ambiant, une p02 suffisant à leur fonctionnement.  Enfin, les expériences ne nécessitent que de petits volumes (1-2 ml) de sérum.

L’étude de la contractilité cellulaire, de la sensibilité à l’isoprénaline et des potentiels transmembranaires a montré une altération du fonctionnement myocardique sous l’influence du sérum de patients en état de choc (phase intermédiaire).  En effet, comparé à un sérum humain normal, le sérum de patients en choc septique provoque une baisse de la contractilité, une inhibition de la réponse chronotrope à l’isoprénaline (Carli et al., 1978) et un élargissement du potentiel d’action.  L’ensemble de ces résultats ont montré qu’il possible, par l’utilisation de cellules cardiaques cultivées, de mettre en évidence des facteurs circulants capables d’expliquer un phénomène physio-pathologique chez l’Homme (des travaux ultérieurs ont permis d’en proposer un mécanisme d’action et même de rechercher des antagonistes).